虾青素对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用

虾青素对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用

作者：裴凌鹏

作者单位：中央民族大学中国少数民族传统医学研究院，北京 100081

【摘要】 目的研究ASTA虾青素对脂多糖（LPS）所致急性肺损伤（ALI）小鼠的保护作用。方法雄性昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组、急性肺损伤模型组、地塞米松阳性对照组(5 mg/kg)以及虾青素低、中、高剂量组(10、15、20 mg/kg)共6组。不同剂量虾青素给大鼠连续灌胃30 d后，腹腔注射脂多糖6.0 mg/kg建立ALI模型。在注射后6 h，收集腹主动脉血并进行左侧支气管肺泡原位灌洗以收集灌洗液，测定血中淋巴细胞亚群（CD+3、CD+4、CD+8）、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素8(IL8)及丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性；测定各组的肺湿重/干重比、肺组织中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)含量及肺组织匀浆TNFα、白细胞介素10(IL10)含量。结果虾青素各剂量组均能降低因LPS诱发的血TNFα、IL8、MPO、MDA含量与肺组织湿重/干重比的升高，同时抑制肺组织IL10含量、血SOD与GSHPx活性的降低，改善血中淋巴细胞亚群分布。结论虾青素对LPS所致ALI具有预防性保护作用。

【关键词】 虾青素；急性肺损伤；脂多糖

急性肺损伤(ALI)是全身炎症导致多器官功能障碍综合征的肺部表现，其严重阶段即为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。研究表明，在ALI/ARDS的发生发展中，免疫细胞功能紊乱和免疫炎性因子失衡在致病过程中作用显著。虾青素是一种类胡萝卜素，主要以全反式异构体形式存在于自然界海洋动物体、藻体及多数陆生植物体（如冰凉花）内并具有多种生物学功能，其中尤以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用突出。由于虾青素国际市场需求的日益增加，针对其潜在防病、治病功能的研究越发引人关注，在以往流行病学统计中就虾青素为预防与治疗呼吸性疾病提供帮助的可能性仅有零星报道，但尚存在一定的争议。为此围绕此类课题开展研究显然具有很重要的理论与临床意义。因此，本实验旨在通过ASTA虾青素对脂多糖诱导小鼠ALI模型进行研究，初步揭示其对此类损伤潜在的预防保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂 Labconco冰冻真空干燥仪（法国乐高公司），752分光光度计（中国伯乐公司），960型荧光分光光度计、J2SH高速冰冻离心机（日本岛津公司），C30柱（YMC Carotenoid S5，Waters），HPLC（Waters 600E溶剂输送系统，PDA2996二极管阵列检测器Waters），脂多糖、地塞米松（美国SIGMA），FITC标记的抗大鼠CD3单克隆抗体、PE标记的抗大鼠CD4和CD8单克隆抗体(美国Caltag公司)，小鼠TNFαELISA试剂盒(武汉博士德公司)，小鼠IL8、IL10 ELISA试剂盒(美国RB公司)，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒及髓过氧化酶(MPO)测定试剂盒(南京建成生物工程公司)，虾青素乳化颗粒（瑞士罗氏DMS公司），乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚（MTBE）（美国迪马公司），大孔吸附树脂（天津农业股份公司）。

1.2 乳化剂破乳制备虾青素

1.2.1 有机萃取称取10 g乳化颗粒加入少许水，超声波促溶后，加入300 ml丙酮正己烷萃取。静置2 h后，将脂溶性相收集（反复萃取直至水相成无色）。再利用减压旋转蒸发仪进行提取液浓缩处理。

1.2.2 虾青素提取液柱色谱纯化 ①装柱。将活化好的氧化铝装填于玻璃层析柱中，装填高度为12 cm，用正己烷润湿。②洗脱。分别取2 ml虾青素提取液上柱，用50 ml正己烷丙酮淋洗，收集洗脱液。将洗脱液用氮气吹干制粉，装入充满氮气的玻璃瓶内，-70℃储存备用。

1.3 虾青素鉴定 参照全反式虾青素标准品，根据其HPLC中保留时间和紫外可见吸收光谱的特征峰进行鉴定。得到的虾青素提取液经过滤后用高效液相色谱分离。色谱条件：色谱柱：Waters YMC Carotenoid S5(4.6 mm×250 mm)；流动相A：乙腈甲醇（V∶V=75∶25）；流动相B：MTBE；流动相A与B中分别加入0.05%三乙胺作为改性剂防止虾青素降解；线性梯度洗脱：B在8 min内由0%增加至55%；8～35 min B维持55%；35～40 min B由55%减至0%；流速：1.0 ml/min;检测波长：l/nm=480；波长范围260～700 nm；进样量：20 μl。并收集后观察其光谱特征峰行为。通过色谱和光谱分析结果表明实验所用灌胃物为全反式虾青素，纯度为95%。

1.4 动物实验

1.4.1 ALI模型的建立与动物分组实验小鼠（购自中国军事医学科学院实验动物养殖中心）按体重随机分为6组：正常对照组、ALT模型组、虾青素低、中、高剂量组（10、15、20 mg/kg）和阳性对照组（地塞米松5 mg/kg），每组10只。虾青素组动物每天给予不同剂量的虾青素，正常对照组、ALI模型、阳性对照组给予溶剂(食用色拉油)，连续灌胃30 d，每周称体重1次，根据体重调整灌胃量。30 d后，各剂量虾青素组、ALI模型组、阳性对照组小鼠分别腹腔注射LPS 6.0 mg/kg，建立ALI动物模型，正常对照组小鼠腹腔注射生理盐水。造模6 h后，股动脉放血处死，结扎右肺，暴露气管进行气管插管，用生理盐水1.5 ml分3次进行支气管肺泡灌洗，收集BALF，取BALF离心后上清2 ml冷冻干燥成干粉；并收集小鼠腹主动脉血.

1.4.2 肺湿重/干重比测定各组小鼠开胸取全部左肺，滤纸吸干，称量湿重，60℃烘烤48 h，称量干重，计算肺组织湿重/干重(W/D)。

1.4.3 肺组织TNFα、IL10及MPO的测定取肺组织匀浆液，采用酶联免疫吸附法测定各组小鼠肺组织中TNFα及IL10的含量。按试剂盒说明书测定MPO，测定过程中需注意低温及避光操作。

1.4.4 动脉血T淋巴细胞亚群CD+3，CD+4和CD+8的检测采集小鼠腹主动脉血2.0 ml，EDTA抗凝后分别取60 μl加入2个流式细胞仪检测专用试管中。具体操作参照文献〔4〕，并严格按试剂说明书进行。

1.4.5 动脉血抗氧化指标检测经3 000 r/min离心10 min，分离血清，测定各组血清中SOD、GSHPx、MDA水平。MDA含量测定方法：硫代巴比妥酸（TBA）比色法；SOD活性测定方法：亚硝酸盐法；GSHPx活性测定方法：5，5双硫代对硝基苯甲酸（DTNB）显色法。

1.4.6 TNFα和IL8的检测采用酶联免疫吸附法测定，用生理盐水300 μl溶解BALF冷冻干粉，分别用TNFα和IL8酶联免疫测定试剂盒，测定该溶液中TNFα和IL8含量。

1.5 统计处理 所有数据用x±s表示，用SPSS10.0统计软件进行统计，组间差异比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1 虾青素对肺组织W/D的影响 与对照组(W/D=4.21)相比，ALI模型组（W/D=5.12），W/D值显著升高(P＜0.01)；与ALT模型组比较，虾青素各剂量组和阳性对照组W/D则分别降低至5.01（虾青素低剂量组）、4.79（虾青素中剂量组）、4.47（虾青素高剂量组）、4.30（阳性对照组），差异显著(P＜0.01)，并显示出一定的量效关系；但虾青素组的疗效不如阳性对照组(P＜0.05)。

2.2 肺组织TNFα、IL10及MPO的测定 表1可见，与对照组比较，ALI模型组小鼠肺组织TNFα、MPO含量显著升高，而IL10含量显著降低(均P＜0.01)。与ALI模型组比较，虾青素各剂量组和阳性对照组IL10含量明显升高，TNFα、MPO含量明显降低(均P＜0.01)，显示出一定的量效关系；但虾青素组的疗效不如阳性对照组(P＜0.01)。

2.3 动脉血T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4和CD+8的检测 表2可见，与对照组比较，ALI模型组小鼠动脉血中T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4和CD+8含量显著降低(P＜0.01)。而与ALI模型组比较，虾青素各剂量组和阳性对照组T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4和CD+8明显升高(P＜0.01)，显示出一定的量效关系；虾青素组的疗效不如阳性对照组(P＜0.01)。

2.4 动脉血抗氧化指标检测 表3可见，与对照组比较，ALI模型组小鼠血中SOD、GSHPx活性显著降低，而MDA含量显著增加(均P＜0.01)。而与ALI模型组比较，虾青素各剂量组和阳性对照组血中SOD、GSHPx活性明显升高，MDA含量明显降低(均P＜0.01)，显示出一定的量效关系；但虾青素组的疗效不如阳性对照组(P＜0.01)。表1 各组肺组织TNFα、IL10及MPO含量与正常对照组相比：1）P＜0.01；与ALI模型组相比：2）P＜0.01；与阳性对照组相比：3）P＜0.01，下表同表2 各组小鼠动脉血T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4和CD+8变化表3 各组小鼠血清SOD、GSHPx活性和MDA含量

2.5 TNFα和IL8的检测 表4可见，与对照组比较，ALI模型组小鼠肺组织BALF中TNFα、IL8含量显著升高(P＜0.01)。与ALI模型组比较，虾青素各剂量组和地塞米松阳性组TNFα、IL8含量明显降低(均P＜0.01)，显示出一定的量效关系；但虾青素组的疗效不如阳性对照组(P＜0.01)。表4 各组小鼠肺BALF中TNFα、IL8含量

3 讨论

诱发ALI的因素众多，但无论开始的刺激因素是细菌性还是非细菌性，其引起的几乎都是一种不易调控的全身性免疫紊乱，免疫细胞过度活化和免疫炎性因子大量释放，导致病理损伤。机体在严重的细菌感染、创伤、烧伤或应激状态下，大量的内毒素与巨噬细胞表面受体结合，巨噬细胞被过度活化，释放大量炎性细胞因子，引起系统性炎性反应综合征(SIRS)，最终导致机体的病理损害甚至死亡。

研究表明当机体摄入LPS，体内肺组织细胞中的自由基代谢平衡就会失调，对自由基的防御能力也会下降，过量自由基可使生物膜脂质双分子层中的不饱和脂肪酸过氧化，而形成脂质过氧化产物，从而使膜结构和功能发生障碍。过氧化脂质的代谢产物MDA，进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成无活性脂褐质，沉积于组织细胞，破坏细胞膜结构，最后导致细胞无法维持正常代谢而死亡。本实验的结果表明，与ALI模型组比较，虾青素各剂量组均升高血SOD、GSHPx活性，降低MDA含量，说明虾青素可以改善LPS所致ALI模型小鼠抗氧化能力。

T细胞对机体细胞免疫和体液免疫类型、强度都有重要调节作用，T淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。CD+3反应总T细胞；CD+4分布于T细胞的辅助细胞诱导亚群和抑制细胞诱导亚群表面，其主要生理功能是诱导B淋巴细胞增生和分化产生抗体，诱导和辅助细胞毒T细胞前身成为细胞毒T细胞，辅助性T淋巴细胞主要通过分泌细胞因子调节杀伤淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等活性； CD+8分布在抑制性和杀伤性T淋巴细胞表面，CD+8通过自身和抑制因子在免疫反应中起负向调节作用，是机体免疫和调节的重要因素。T细胞调控网络失去平衡，可导致机体发病，如辅助性T细胞功能低下，机体易发生感染，抑制性T细胞功能低下可能发生过强免疫反应。本研究结果显示，ALI模型组小鼠CD+3、CD+4、CD+8有降低趋势，而虾青素不同剂量组均高于ALI模型组。

TNFα是ALI炎症反应中重要的启动因子，也是介导早期ALI的主要细胞因子。它可以直接损伤肺血管内皮细胞，活化中性粒细胞(PMN)，使得PMN黏附并脱颗粒及呼吸爆发，造成肺组织损伤，并能刺激IL1、IL6、IL8等的产生，形成纵横交错的细胞因子作用网络，介导炎症反应损伤肺组织。IL8是PMN最有效和最主要的趋化因子。在游离IL8形成的浓度梯度的趋化下，PMN穿过内皮进入肺间质与肺泡腔，到达肺组织的PMN继续受到IL8的强烈刺激，发生呼吸爆发和脱颗粒现象，释放出大量的损伤介质引起肺损伤。ALI时IL8升高较晚但持续时间长，因此IL8在ALI发病后期损伤及预后转归上起着更为重要的作用。而IL10为抗炎因子，主要是由单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞产生，影响前炎症细胞因子的产生。本实验表明：虾青素呈剂量依赖性地抑制TNFα、IL8的分泌，而提高IL10。

综上所述，虾青素能降低由于LPS诱发的肺组织W/D、TNFα、IL8、MPO活性升高，增强IL10分泌与抗氧化能力，改善T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4、CD+8分布，表明虾青素可能通过调节促炎性因子、抗炎因子的释放以及拮抗氧应激对肺组织产生保护作用，其确切机制有待进一步研究。此外，ASTA虾青素虽作用效果略逊于地塞米松，但由于其是一种天然食用安全的化合物，所以未来应用前景更显优势。